Нанесение буферного агента pH на поверхность, прошедшую пескоструйную обработку и травление кислотой, после ее облучения вакуумным ультрафиолетовым излучением (фотофункционализации) дентальных имплантатов

резюме

Фотофункционализация ультрафиолетовым излучением (УФ) останавливает биологическое старение титана за счет трансформации гидрофобной поверхности титановых имплантатов в супергидрофильную. Формирование кровяного сгустка в области имплантата запускает процесс заживления тканей на границе имплантата с костью. Целью настоящего исследования является сравнение смачиваемости трех типов поверхности имплантата и оценка влияния их характеристик на образование кровяного сгустка. В ходе исследования анализировали три
метода обработки поверхности: пескоструйную обработку и травление кислотой (SA); пескоструйную обработку, травление кислотой и облучение вакуумным ультрафиолетовым излучением (SA + VUV); пескоструйную обработку, травление кислотой и нанесение буферного агента pH после облучения вакуумным ультрафиолетовым излучением (SA + VUV + BS). Смачиваемость поверхностей SA + VUV и SA + VUV + BS (n = 5) и образование кровяного сгустка в области имплантатов анализировали с помощью статических и динамических тестов in vitro. Гемостаз
оценивали in vivo, сопоставляя процесс свертывания крови в области поверхностей SA, SA + VUV и SA + VUV + BS (n = 4). Анализ с использованием критерия Краскела-Уоллиса выявил статистически значимую разницу между группами (p < 0,05) во всех тестах, за исключением теста на статическое свертывания крови in vitro. Полученные данные свидетельствуют о том, что облучение поверхности SA вакуумным ультрафиолетовым излучением придает ей выраженные гидрофильные свойства и является эффективной альтернативой традиционному облучению
коротковолновым ультрафиолетовым излучением (УФ-С). Нанесение буферного агента pH на поверхность SA после ее облучения вакуумным УФ увеличивало смачиваемость поверхности и способствовало формированию кровяного сгустка, обеспечивая успешную остеоинтеграцию имплантата.

цель

Благодаря своим механическим свойствам, биосовместимости и высокой устойчивости к коррозии титан широко используется в стоматологии и ортопедической хирургии. При окислении титана на его поверхности быстро образуется тонкий (1-5 нм) стабильный пассивный слой, защищающий поверхность металла от дальнейшего окисления. По данным исследований, ионы кальция и фосфора из костного матрикса перемещаются внутрь слоя TiO₂: этот процесс лежит в основе биологической эффективности титановых имплантатов. Однако с течением
времени биологическая эффективность титана снижается из-за неизбежного осаждения углерода из атмосферного воздуха на слое TiO в форме углеводорода. Это явление называют биологическим старением титана, поскольку способность титановых поверхностей притягивать белки и остеогенные клетки уменьшается с течением времени. Другим значимым изменением характеристик титановых поверхностей является утрата ими гидрофильных свойств. Непосредственно после обработки угол краевого смачивания титановой поверхности при
контакте с водой составляет 0° или менее 5° - такие поверхности называются супергидрофильными.Через 2 и 4 недели угол краевого смачивания увеличивается до 40° и 60° соответственно, что говорит о превращение гидрофильной поверхности в гидрофобную.

Обработка поверхности имплантата для изменения ее топографии и энергии позволяет увеличить смачиваемость поверхности, усилить пролиферацию и рост клеток, и ускорить остеоинтеграцию имплантата. Существуют аддитивные и субтрактивные методы обработки поверхности.  Субтрактивная методика предусматривает удаление слоя материала или придание поверхности большей шероховатости. Примером субтрактивного метода может служить поверхность SA, прошедшая пескоструйную обработку и травление кислотой. Аддитивная методика заключается в нанесении на поверхность других материалов или химических агентов. В качестве примера можно упомянуть плазменное напыление титана, нанесение на поверхность слоя гидроксиапатита, фосфата кальция и других биомиметических покрытий. Формирование остеотомического отверстия для установки имплантата приводит к травме костной ткани, схожей с переломом. В области имплантации развивается гипоксия, внеклеточный рН снижается. В подобных условиях стромальные клетки костного мозга характеризуются
пониженной активностью щелочной фосфатазы (ЩФ) и уменьшением синтеза коллагена, играющих важную роль в формирования костной ткани и остеоинтеграции имплантата.По данным исследований, уровень кислотности влияет на гликолиз и синтез ДНК остеобластов. Внеклеточный ацидоз опосредованно замедляет тромбогенез и агрегацию тромбоцитов (один из ключевых этапов формирования кровяного сгустка), воздействуя на транспорт ионов кальция. Формирование стабильного кровяного сгустка обеспечивает непосредственный контакт между костью и имплантатом и играет важную роль в тромбогенном ответе и остеоинтеграции имплантата. Результаты исследований указывают на наличие взаимосвязи между характеристиками поверхности имплантата и размером
фибринового сгустка.

Автора настоящей статьи оценивали характеристики новой поверхности SA, на которую наносили буферный агент рН после облучения вакуумным ультрафиолетом, в ходе предыдущих исследований.Согласно полученным данным, поверхность этого типа характеризовалась более выраженной аффинностью к белкам, клеткам и тромбоцитам, способствуя быстрому и стабильному свертыванию крови, тромбогенезу и остеоинтеграции имплантата. Настоящее исследование направлено на сравнение смачиваемости трех типов поверхности имплантатов и оценку влияния их характеристик на образование кровяного сгустка. В ходе исследования в условиях in vivo и in vitro анализировали три метода обработки поверхности: пескоструйную обработку и травление кислотой (SA); пескоструйную обработку, травление кислотой и облучение вакуумным ультрафиолетовым излучением (SA + VUV); пескоструйную обработку, травление кислотой и нанесение буферного агента pH после облучения вакуумным ультрафиолетовым излучением (SA + VUV + BS).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

• Подготовка имплантатов
  
  В рамках настоящего исследования использовали имплантаты из коммерчески чистого титана (класс IV) с тремя типами поверхности: SA, SA + VUV (TS III SA, Osstem, Сеул, Корея) и SA + VUV + BS (TS III SOI, Osstem). Шероховатость поверхности (Ra) имплантатов составляла 2,5 ± 0,5 мкм (рис. 1a, 1b). Фотофункционализацию поверхности проводили с помощью облучения дуговыми ртутными лампами низкого давления, излучающими УФ-С и ВУФ, в УФ-озонаторе в течение одного часа. Для придания поверхности супергидрофильных свойств на нее наносили
  буферный агент рН, включающий положительно и отрицательно заряженные ионные группы с pKa (показатель константы кислотности) равном 7,31 при температуре 37 °C (рис. 1c).Рис. 1. Морфологический анализ поверхности, прошедшей пескоструйную обработку и травление кислотой (SA), с помощью растрового электронного микроскопа (РЭМ) при увеличении ×500 (а) и ×4000 (b); (c). Сравнение углов краевого смачивания при нанесении дефибринированной овечьей крови на титановые диски и имплантаты. SA – стандартная поверхность SA; SA + VUV + BS - поверхность SA, покрытая буферным агентом рН после облучения вакуумным ультрафиолетом
  
  
• Статическая смачиваемость поверхности
  
  Блюдо диаметром 3,5 см заполнили гепаринизированной овечьей кровью на 2–3 см. Имплантаты SA + VUV и SA + VUV + BS (по 5 имплантатов каждого типа) погружали в кровь до верхней границы вертикальных канавок. Для оценки скорости смачивания измеряли время, проходящее с момента погружения имплантата в кровь до смачивания кровью его шейки. Измерение временем, необходимого для смачивания всей поверхности имплантата от его апекса, представлялось нецелесообразным из-за наличия вертикальных канавок, разрывающих витки резьбы и препятствующих адсорбции крови.
  
  
• Динамическая смачиваемость поверхности
  
  Для имитации установки имплантатов в реальной клинической ситуации в прозрачной акриловой пластине сформировали отверстия с помощью хирургического набора 122 Taper (Osstem) в соответствии с протоколом производителя для твердой кости. В каждое отверстие наливали по 130 мкм дефибринированной овечьей крови, после чего в отверстия погружали имплантаты SA + VUV и SA + VUV + BS (по 5 имплантатов каждого типа) с помощью силоизмерительного устройства (MX-500N, Imada Co., Токио, Япония) со скоростью 50 мм/мин. В ходе эксперимента замеряли время, за которое кровь достигала отметок 2 мм и 4 мм относительно края горизонтальной пластины вдоль центральной оси имплантата (рис. 2).Рис. 2. Оценка динамической смачиваемости поверхности in vitro: (a) прозрачная акриловая пластина с отверстиями для имплантатов и силоизмерительное устройство; (b) исходная ситуация; апекс имплантата соприкоснулся с кровью; имплантат полностью ввели в отверстие
  
  
• Статическое свертывание крови
  
  Имплантаты SA + VUV и SA + VUV + BS (11,5 мм х 4,5 мм; n = 5) погружали в блюдце диаметром 3,5 см, заполненное 3 мл негепаринизированной овечьей крови. Вес (г) кровяного сгустка на поверхности имплантатов измеряли через 5, 7,5, 10 и 12,5 минут соответственно.
  
  
• Динамическое свертывание крови
  
  Тест на активное свертывание крови был разработан для имитации непрерывного поступления крови по капиллярам. Имплантаты SA + VUV и SA + VUV + BS (10 мм х 4 мм; n = 5) фиксировали в модифицированной пробирке Эппендорфа с усилием 5 Нсм. Пробирка была подключена к шприцевому насосу, подающему овечью кровь, смешанную с 1 МЕ/мл гепарина при температуре 37 °C. Через 30 минут подачи крови со скоростью 0,05 мл/мин измеряли время (мин) до образования кровяного сгустка вокруг имплантата и объем (мл) крови, которая
  собиралась в пробирке объемом 15 мл, расположенной под пробиркой Эппендорфа.
  
  
• Исследование in vivo
  
  Эксперимент проводили на собаках породы бигль. Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по этике институционального комитета по защите животных и их использованию в экспериментах (CRONEX-IACUC 20191002; Cronex, Хвасон, Южная Корея) в соответствии с принципами “ARRIVE” (исследования на животных: эксперименты in vivo).
  Четырем самкам собак породы бигль (возраст 18 месяцев) удалили премоляры и первые моляры с обеих сторон нижней челюсти в условиях общей анестезии. Протокол анестезии включал внутримышечную инъекцию 15 мг/кг тилетамина/золазепама (Zoletil 50, Virbac, Сеул, Южная Корея) и 5 мг/кг ксилазина (Rompun, Bayer Korea, Сеул, Южная Корея). После выполнения местной анестезии отслоили полнослойный лоскут в проекции премоляров и моляров нижней челюсти (рис. 3). Зубы разделили на фрагменты, используя обильное водяное охлаждение, с помощью малого фиссурного бора. Зубы удалили с помощью элеваторов и щипцов. Края раны ушили простыми узловыми швами. В послеоперационном периоде назначили антибиотики и обезболивающее; собак кормили мягкой пищей и давали им воду ad libitum.Рис. 3. Тест на свертываемость крови in vivo: (a) выполнение разреза и отслаивание лоскута; (b) сглаживание края альвеолярного гребня; (c) формирование остеотомических отверстий для имплантатов; (d) установка имплантатов; (e) размещение ватного тампона в зазоре между имплантатом и остеотомическим отверстием; (f) внешний вид ватных тампонов в зависимости от времени. SA: стандартная поверхность SA; SA + VUV: поверхность SA, облученная вакуумным ультрафиолетовым излучением; SA + VUV + BS: поверхность SA, покрытая буферным агентом pH после облучения вакуумным УФ
  
  Через три месяца после удаления зубов собакам установили дентальные имплантаты в стерильных условиях. После выполнения местной анестезии отслаивали полнослойный лоскут для обнажения альвеолярного гребня. Неровный альвеолярный гребень выравнивали. Остеотомические отверстия формировали, используя следующую последовательность сверл: направляющее сверло, спиральное сверло 2,2 мм, коническое сверло 3 мм, коническое сверло 4 мм, коническое сверло 6 мм. Диаметр остеотомического отверстия был больше диаметра имплантата. В общей сложности установили 12 имплантатов SA, SA + VUV и SA + VUV + BS (8,5 мм х 3,5 мм) с усилием 35 Нсм. В зазор между имплантатом и ложем помещали ватный тампон, который пропитывался кровью в течение не более 10 минут. Для оценки процесса образования кровяного сгустка в области имплантата вес (г) ватного тампона измеряли каждую минуту. После хирургического вмешательства животных усыпили с помощью внутривенной инъекции хлорида калия.
  
  
• Статистический анализ
  
  Из-за небольшого размера выборки для выявления разницы между группами SA + VUV и SA + VUV + BS in vitro, а также между группами SA, SA + VUV и SA + VUV + BS in vivo использовали критерий Краскелла-Уоллиса (непараметрический критерий). Разницу считали статистически значимой, если p < 0,05 при  = 0,05. Статистический анализ проводили в программном обеспечении SAS, версия 9.4 (SAS Inc., Кэри, США).

РЕЗЮМЕ

• Тесты in vitro
  
  Cтатическая смачиваемость поверхности Кровь достигала шейки имплантата за 43,3 ± 8,3 минуты и 3,8 ± 0,3 минуты в группах SA + VUV и SA + VUV + BS соответственно. Статистически значимая разница (p < 0,05) между группами была очевидна (рис. 4a).Рис. 4. Тест на статическую и динамическую смачиваемость поверхности in vitro: (a) время (мин), за которое кровь доходит до шейки имплантата; (b) время (мин), за которое кровь доходит до отметок 2 мм и 4 мм над горизонтальной пластиной соответственно. SA: стандартная поверхность SA; SA + VUV: поверхность SA, облученная вакуумным ультрафиолетовым излучением; SA + VUV + BS: поверхность SA, покрытая буферным агентом pH после облучения вакуумным УФ. Среднее значение ± стандартное отклонение,* p < 0,05 при использовании критерия Краскелла-Уоллиса.
  
  
• Динамическая смачиваемость поверхности
  
  В группе SA + VUV кровь достигала отметки 2 мм и 4 мм над горизонтальной пластиной за 6,4 ± 0,1 мин и 8,5 ± 0,2 мин соответственно. В группе SA + VUV + BS на достижение кровью отметок 2 мм и 4 мм над горизонтальной пластиной уходило 8,5 ± 0,2 мин и 9,3 ± 0,3 мин соответственно. Статистически значимая разница (p < 0,05) между группами SA + VUV и SA + VUV + BS была обнаружена только при сравнении времени, в течении которого кровь достигала отметки 4 мм (рис. 4b).
  
  
• Статическое свертывание крови
  
  В группе SA + VUV вес кровяного сгустка, сформировавшегося в области имплантата через 5, 7,5, 10 и 12,5 минут, составлял 0,04 ± 0,01 г, 0,09 ± 0,03 г, 0,23 ± 0,06 г и 0,39 ± 0,16 г соответственно. В группе SA + VUV + BS вес кровяного сгустка через аналогичные промежутки времени достигал 0,07 ± 0,03 г, 0,12 ± 0,02 г, 0,39 ± 0,20 г и 0,61± 0,18 г соответственно. Статистически значимая разница между группами SA + VUV и SA + VUV + BS отсутствовала (p > 0,05).
  
  
• Динамическое свертывание крови
  
  Для достижения полного гемостаза требовалось 19 ± 0,4 мин и 8,1 ± 1,2 мин в группах SA + VUV и SA + VUV + BS соответственно. Разница между группами была статистически значимой (p < 0,01, рис. 5a). Объем крови, скопившейся в пробирке, достигал 8,27 ± 0,36 мл и 3,64 ± 0,99 мл в группах SA + VUV и SA + VUV + BS соответственно: разница между группами была статистически значимой (p < 0,01, рис. 5b).Рис. 5. Тест на динамическое свертывание крови in vitro: (a) время (мин) до полного гемостаза; (b) объем (мл) крови, собранной в пробирке. SA: стандартная поверхность SA; SA + VUV: поверхность SA, облученная вакуумным ультрафиолетовым излучением; SA + VUV + BS: поверхность SA, покрытая буферным агентом pH после облучения вакуумным УФ. Среднее значение ± стандартное отклонение,* p < 0,01 при использовании критерия